近日，上海科技大学物质科学与技术学院李健课题组在无细胞生物合成天然产物方面取得新进展，相关成果发表于美国化学会ACS Synthetic Biology期刊，该成果入选ACS Editors' Choice亮点文章，并作为头条新闻在美国化学会网站报道。
ACS Editors' Choice是由美国化学会（ACS）期刊编辑挑选出的在相关研究领域具有重要影响力的论文。ACS每年从旗下所有期刊发表的数万篇论文中选取365篇作为每日推荐论文，入选率不到1%。
研究论文在美国化学会网站予以亮点报道
近年来，李健课题组致力于无细胞合成生物学研究，主要方向之一是无细胞生物合成高价值天然产物（Current Opinion in Microbiology, 2022）。已实现多种天然产物的体外生物合成，如非核糖体多肽类抗生素缬氨霉素（Metabolic Engineering, 2020）、茶氨酸（ACS Synthetic Biology, 2021）以及农业除草剂thaxtomin A的前体化合物L-4-硝基色氨酸（Synthetic and Systems Biotechnology, 2022）等。
含有末端炔基的化合物能够发生“点击”化学反应，可用于药物发现、蛋白质谱分析、生物正交反应以及构建生物探针等，具有重要应用价值。本研究选取含有末端炔基等特殊功能基团的非天然氨基酸为研究对象，探索无细胞合成生物学在该类化合物合成领域的创新应用潜力。
基于已报道的β-乙炔基丝氨酸的生物合成途径，通过催化起始底物赖氨酸有望实现多种赖氨酸衍生物的合成，获得终产物β-乙炔基丝氨酸。但参与第三步催化反应的酶蛋白（BesB，裂解酶）无法实现体内异源可溶表达，只能选用BesB的同工酶作为替代。针对这一棘手问题，课题组采用了无细胞体系的解决策略。
利用基于大肠杆菌的无细胞蛋白表达体系，研究人员对BesB进行了表达和优化，成功实现了BesB的体外可溶性表达。对BesB和其他四个相关蛋白在无细胞体系中的催化活性进行验证，发现每个酶蛋白在无需纯化的情况下都可在反应体系内直接进行相应的催化反应。通过单步或组合酶催化，最终实现了不同赖氨酸衍生物的体外生物合成，包括4-氯-赖氨酸、4-氯-烯丙基-甘氨酸以及炔丙基甘氨酸等非天然氨基酸，也合成了目标终产物γ-谷氨酰-β-乙炔基丝氨酸（一种带有炔基的二肽类化合物）。值得一提的是，本研究发现大肠杆菌体内的一种内源蛋白羧酸胺连接酶（YbdK）与该合成途径中的酶蛋白BesA具有同工作用，亦可催化炔丙基甘氨酸与谷氨酸的缩合反应，生成中间产物γ-谷氨酰-炔丙基甘氨酸。
五步酶催化反应途径及无细胞生物合成工作流程
该工作进一步证明了无细胞体系在合成天然产物方面的优势，一是无细胞体系对表达体内难溶蛋白的突出能力，实现了BesB的体外可溶表达（体内异源表达时BesB完全不可溶）；二是扩充了无细胞体系表达天然产物合成酶蛋白的范围（如卤化酶BesD等）；三是拓展了无细胞生物合成天然产物的种类，如含有末端炔基的非天然氨基酸等。随着无细胞生物技术的快速发展，无细胞体系将为天然产物研究提供新的思路与契机，在构建高效、高产的天然产物体外生物合成平台等方面具有广阔的应用前景。
上海科技大学物质学院2020级硕士研究生陈伊琳为论文第一作者，李健教授为通讯作者，上海科技大学为唯一完成单位。
论文标题：
Cell-Free Biosynthesis of Lysine-Derived Unnatural Amino Acids with Chloro, Alkene, and Alkyne Groups
论文链接：
https://doi.org/10.1021/acssynbio.3c00132