靶向遗传筛选是揭示细菌基因型-表型之间联系和研究细菌复杂调控网络机制的关键技术。然而，目前细菌中常用的靶向遗传筛选方法，例如MAGE（多重自动基因组改造）和TRMR（可追踪多元重组工程），高度依赖于特殊的重组酶，只能适用于十分有限的物种中，缺乏普适性。基于CRISPR-Cas9/Cas12a（一种基因编辑工具）的靶向遗传筛选系统，通过利用基因组非同源末端连接修复机制，能够在真核细胞中实现高效的靶向遗传失活筛选。然而，多数细菌中缺乏高效的非同源末端连接修复机制，因而CRISPR-Cas9/Cas12a不能应用于细菌中靶向遗传失活筛选。因此，亟需在细菌中开发普适性的靶向遗传筛选系统。
近日，上海科技大学的季泉江课题组与中山大学的骆观正课题组合作，在Cell Reports发表了题为“Targeted genetic screening in bacteria with a Cas12k-guided transposase”的文章，报道了名为Site-specific Transposon-Assisted Genome Engineering （STAGE，定点转座基因组改造）的靶向遗传筛选新方法。该方法通过整合高通量DNA合成、CRISPR-Cas12k引导的转座酶和双重筛选策略实现细菌中普适性的靶向遗传筛选，将促进细菌基因组进化和细菌功能基因组学等研究。
CRISPR-Cas12k引导的转座酶系统（ShCAST）是一种由Cas12k、gRNA、TniQ/TnsBC转座酶构成的定向转座系统。利用Cas12k/gRNA复合物的基因组识别和定位功能，TniQ/TnsBC能够“移花接木”一般将一段外源DNA序列插入到细菌基因组的特定位点，实现对细菌基因组的定向转座。研究人员成功地将ShCAST系统应用于铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌的基因组定向转座，并通过引入抗生素和蔗糖的双重筛选策略，高效富集了正确转座的突变菌株，从而利于后续大规模靶向转座文库构建。
图| 细菌中STAGE文库构建策略与系统评价
由于STAGE系统只需要改变gRNA上的靶向spacer序列，就能实现对不同位点的转座，因此适用于细菌大规模靶向转座文库的构建。通过DNA高通量合成，研究人员构建了针对铜绿假单胞菌所有转录因子的细菌突变文库，并进一步通过定量扩增子测序策略，评估了构建的菌株库的质量。测序结果显示98.5%的靶基因都成功发生了转座，验证了该系统可以有效应用于细菌大规模靶向文库构建。
利用铜绿假单胞菌转录因子的突变文库，研究人员筛选了铜绿假单胞菌抗生素耐药性的基因和相关通路。通过对药物处理前后不同gRNA介导的插入事件数量的统计，研究人员分别鉴定到了不同的耐药/敏感基因。为了验证从STAGE文库中鉴定出的基因在抗生素耐药性中的作用，研究人员使用基于CRISPR-Cas9的基因组编辑技术重建了可信的突变体，药物筛选的结果与STAGE突变文库鉴定的结果一致。这些发现表明STAGE方法是一种有效且可靠的工具，可用于基因型-表型关系的高通量分析。
研究证实，STAGE是一种使用Cas12k引导的转座酶在不同微生物物种中进行高通量位点特异性基因组工程的全新方法。除基因定点失活外，STAGE还可用于将功能基因组元件高通量地整合到不同微生物物种的目标基因组位点中，这是以往依赖同源重组或随机转座子诱变的方法难以实现的。此外STAGE方法也可用于混合细菌群落中的多重基因破坏和物种特异性遗传操作。
上海科技大学物质学院副研究员陈未中和中山大学博士生任泽慧为本文的共同第一作者，上海科技大学季泉江教授和中山大学骆观正教授为本文的共同通讯作者，上海科技大学为论文第一完成单位。该工作得到国家自然科学基金、科技部重点研发计划、上海市自然科学基金、广东省自然科学基金、广州实验室应急项目的支持。
论文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211124721010780
图 文 季泉江
排 版 张丽敏
编 辑 陈 蕾
高 瑄