科研进展|上科大季泉江课题组与合作者在微型基因编辑器工作机制解析和性能优化方面取得新进展

时间:2023-08-23浏览:129设置


 近日,上海科技大学物质科学与技术学院季泉江教授课题组与西湖大学申怀宗教授课题组合作在《自然·催化》 (Nature Catalysis) 杂志发表了最新成果。该研究通过冷冻电镜技术解析了微型基因编辑系统CRISPR-AsCas12f1的三元复合体结构,揭示了其精细结构特征与工作机制,并基于结构引导的蛋白质理性设计,系统性提升了它在哺乳动物细胞中的基因编辑活性。
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CRISPR-Cas基因编辑技术由于其简便性和高效性,已被广泛应用在生物医药、农业育种、合成生物学等领域。当下较为常用的Cas9Cas12a核酸酶通常具有较大分子尺寸(大于1,000个氨基酸),而用于递送基因编辑器的病毒载体往往承载容量十分有限,在容纳CRISPR核酸酶与引导RNA编码序列之余已难以承载其他功能元件,因此严重限制了这类大尺寸基因编辑器的应用。近年来,发掘和鉴定小尺寸Cas核酸酶已成为基因编辑领域的研究热点。我校物质学院季泉江教授团队于2021年首次证明了一种微型基因编辑器AsCas12f1(仅包含422个氨基酸,仅有Cas9分子尺寸的三分之一)的编辑活性(Nat. Chem. Bio.2021)。该发现在拓宽基因编辑器领域边界的同时,也引出许多科学问题,例如:如此小尺寸的核酸酶如何行使基因编辑这般复杂的生物功能?它与大尺寸核酸酶之间在演化上有什么样的联系?

为探索上述问题,我校物质学院季泉江教授团队与西湖大学申怀宗教授团队合作,通过冷冻电镜技术解析了AsCas12f1核酸酶、引导RNA和靶DNA的三元复合体的结构(分辨率为2.7 Å)。结果表明,小尺寸核酸酶AsCas12f1可以形成不对称同源二聚体结构,从而结合一分子的引导RNA,并靶向结合于靶DNA序列上,这样独特的分子结构使核酸酶AsCas12f1能够通过更小的分子尺寸来行使和大型核酸酶相似的基因编辑功能。AsCas12f1核酸酶的引导RNA亦十分独特,它包含一个多茎环组成的同轴RNA螺旋结构,对引导RNA的整体稳定性以及核酸酶活性至关重要。相较其它Cas核酸酶的同源复合体结构,研究发现该同轴RNA螺旋结构可被蛋白中额外增加的锌指结构域所替代。因此,最初的核酸酶可能仅由RNA组成,随着演化,蛋白结构元件逐渐增多,并逐步替代了RNA结构元件。这一发现为进一步理解Cas核酸酶的演化过程提供了新的证据,亦支持了RNA世界假说。研究还揭示了AsCas12f1自发形成同源二聚体的具体分子机制、识别原始间隔邻近基序(Protospacer-adjacentmotif, PAM)的关键氨基酸残基位点、以及同源二聚体中各个单体核酸酶分子对引导RNA结合、底物识别与切割的具体分工。这些发现为进一步工程改造该系统、提升其在哺乳动物细胞的基因编辑活性提供了理论基础。

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图1:AsCas12f1核酸酶分子结构与工程进化

本研究还对微型基因编辑器AsCas12f1进行了工程改造,改造后的AsCas12f1-v5.1在哺乳动物细胞中的基因编辑活性较原始的野生型AsCas12f1提升了1.5~13.5倍。新的CRISPR-AsCas12f1系统具有超迷你的分子尺寸(422个氨基酸),可满足AAV等病毒递送系统对分子尺寸的严苛要求。经无偏倚、无富集的平行比较,AsCas12f1-v5.1基因编辑性能可媲美常用的大型核酸酶Cas9Cas12a。全基因组范围内的脱靶评估表明,AsCas12f1-v5.1的基因编辑安全性显著优于常用的大型核酸酶。本研究为工程化改造CRISPR基因编辑器提供了新的参考,为基因治疗的临床应用提供了新利器。

      上海科技大学季泉江课题组助理研究员吴兆韡博士、博士研究生潘登和西湖大学生命学院刘栋梁博士为共同第一作者。上海科技大学季泉江教授和西湖大学申怀宗教授为共同通讯作者。上海科技大学为第一完成单位。


论文标题:
Structure and engineering of miniature AcidibacillussulfuroxidansCas12f1
论文链接:
https://www.nature.com/articles/s41929-023-00995-4

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